ТРЕХМЕРНАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ микроскопических ИЗОБРАЖЕНИЙ

Биообъекты по своей природе трехмерны. Однако, как правило, по условиям эксперимента исследователь имеет доступ к некоторым плоским модификациям объемной структуры. В тех случаях, когда объект непрозрачен, а интерес представляет его внутренняя структура, единственная возможность вести наблюдение - рассечение объекта. Одной из основных сложностей микроскопического анализа в настоящее время является необходимость распространять данные, полученные на отдельных срезах (сечениях), на структуру в целом.

- 190 -

могут представлять интерес, относятся: величина поверхности объекта, объем, число структур в единице объема, форма объекта. В последнее время эффективно стало развиваться новое синтетическое направление, получившее название стереологии, которое развивает общие принципы восстановления трехмерной структуры по плоским сечениям. Ее успехи во многом связываются с автоматизацией микроскопических исследований, с использованием вычислительной техники в биологическом эксперименте. В последнее время стало очевидным, что использование методов когерентной оптики и голографии предоставляет некоторые новые возможности в задачах такого вида. Например, чрезвычайно эффективна может быть предварительная обработка микроскопических изображений. В основа многих стереологических измерений лежит принцип Кавальери, согласно которому можно заменить измерение площадей измерением отрезков прямых линий, а измерение объемов - измерением площадей. Это позволяет определить объем микрочастиц по их плоским сечениям, а площадь этих сечений оценивать по отрезкам линий. Чрезвычайно интересные результаты может дать анализ ориентированных систем поверхностей и количественная оценка степени ориентации.

Обнаружение определенных форм биообъектов возможно методами двумерной согласованной фильтрации. В задачах стереологии такая система может быть использована для обнаружения характерных участков изображения на плоских срезах. Мы уже рассказывали о возможностях использования двумерной согласованной фильтрации для обнаружения определенных биообъектов. Говорилось о необходимости выполнения некоторых ограничений, касающихся стационарности фона, аддитивного взаимодействия изображений объекта и фона, согласования информационной емкости фильтра с диапазоном возможных изменений формы объекта /1/.

Существует принципиальная возможность восстановления трехмерной структуры по синтезированным на ЦВМ голограммам Френеля отдельных срезов. В случае прозрачных объектов в плоскость голограммы последовательно переносятся распределения амплитуд, заданные в каждой из плоскостей объекта. Это позволяет получить изображение объекта, в котором каждую плоскость можно видеть через расположенные перед ней плоскости. Для объектов непрозрачных преобразование производится последовательно от плоскости к плоскости, поскольку при этом могут быть введены коэффициенты передачи, учитывающие влияние предыдущих плоскостей. По данным Эдгара /2/ для получения голограммы, содержащей N плоскостей, требуется N+1 операция по выполнению преобразования Фурье и N операций комплексного перемножения на "чирп-фактор". В настоящее время говорить о качественном восстановлении трехмерного микроскопического изображения методами цифровой голографии видимо преждевременно.

Помимо восстановления трехмерной структуры по набору плоских сечений, исследуемых стереологией, существует в микроскопическом анализа задача восстановления трехмерной структуры по набору плоских проекций, чрезвычайно актуальная в электронной микроскопии. Электронный микроскоп с высоким разрешением имеет глубину фокусировки в несколько тысяч ангстрем и воспроизводит фактически изображение наложенных друг на друга различных уровней в трехмерной структуре. Причем фокусирование не может быть использовано для разделения уровней внутри объекта. Трехмерная интерпретация молекулярных структур имеет исключительно важное значение, т.к. свойства биологических молекул во многом определяются их пространственной организацией.

У многих растений и животных идентифицированы гены, определяющие морфологические признаки. Наиболее удобными объектами для выяснения того, каким образом гены осуществляют свою формообразующую функцию, являются бактериофаги. Исследование тонкой структуры фага затруднено, поскольку на электронно-микроскопическом изображении мы видим результат наложения различных по толщине уровней. Методы двумерной фильтрации в когерентных оптических системах позволяют достаточно надежно интерпретировать трехмерную

- 192 -

структуру фагов по их электронно-микроскопическим изображениям. В структуре хвоста фага белковые субъединицы расположены по спиральным линиям, навернутым на цилиндрическую поверхность. При этом изображение дальней стороны частицы накладывается на изображение передней стороны, что затрудняет детальное исследование структуры. В дифракционном спектре частицы удалось выделить порядки, соответствующие каждой из сторон частицы. Этому способствовал тот факт, что законы дифракции на спиральных структурах изучены достаточно хорошо. Дифракционный спектр двустороннего объекта описывается совокупностью Бесселевых функций определенных порядков и для модельной структуры представляет собой два ряда по шесть порядков, которые связаны между собой зеркальной симметрией относительно вертикальной линии, проходящей через область нулевых пространственных частот /3/. Блокирование спектральных составляющих, соответствующих дальней стороне частицы, позволяет точно представить структуру передней стороны. Нулевые частоты - общие для обеих сторон, поэтому для сохранения контраста эти порядки должны быть ослаблены вполовину в процессе фильтрации. Асимметрия в дифракционных спектрах реальных объектов связывается с вариациями в проникании контрастирующего вещества в различные канавки спирали на ближней и дальней сторонах частицы.

В последнее время стали разрабатываться точные методы восстановления трехмерной структуры по набору плоских проекций. Осуществление таких операций возможно комбинацией когерентно-оптических и вычислительных методов. Идея одного из методов сводится к тому, что при некоторых допущениях преобразование Фурье электронно-микроскопического изображения, представляющего проекцию трехмерной структуры на плоскость, эквивалентно преобразованию Фурье центрального сечения трехмерной структуры. Выполнение преобразования Фурье для набора проекций, наблюдаемых под разными углами, и последующий Фурье-синтез позволяет восстановить трехмерную структуру объекта. Полученный в оптической системе двумерный спектр объекта позволяет уточнить основные параметры опирали. С помощью микроскопической сканирующей системы электронно-микроскопическое изображение преобразуется в последовательность

- 195 -

электрических сигналов, которые после дискретизации вводятся в ЦВМ. Далее в цифровой форме выполняется преобразование Фурье. При этом устанавливается не только амплитуда, но и фаза каждой спектральной составляющей. Число необходимых проекций для трехмерного восстановления структуры зависит от характера симметрии, размеров частиц и требуемого разрешения. После выполнения обратного преобразования Фурье данные выводятся из машины в виде распределения плотности, на основании которых отроится модель. Такого рода методы важны при анализе пространственной организации некоторых мышечных белков, структуры вирусов, фагов и др. Например, предполагалось, что один из мышечных белков - актин представляет собой двойную спираль, набранную из глобулярных субъединиц /4/. После проведения указанных выше операций из машины были выведены распределения плотности молекулярной структуры актина в плоскости, перпендикулярной спиральной оси с интервалом в 6Å. На основа полученных данных была построена уточненная модель, из которой стало очевидно, что структура актина действительно двойная спираль, но набранная не из круглых, в из плоских субъединиц. Выполнение преобразования Фурье возможно и оптическими методами. Однако для регистрации фазовой информации о структуре спектра необходимо фиксировать результат интерференции спектральных составляющих с когерентным фоном, т.е. синтезировать голограммы Фурье. Фазовая информация при этом проявляется в виде изменения взаимного положения систем интерференционных полос.

Использование голографии возможно и на стадии синтеза. В этом случае голограмма, объединяющая информацию о некоторых состояниях объекта, восстанавливает его трехмерное изображение. В работе /5/ производилось последовательное во времени наложение сфокусированных изображении, сделанных из разных точек наблюдения, на одной голограмме, которая между экспозициями поворачивалась на угол, равный соответствующим направлениям наблюдения. Т.к. в процессе регистрации эталонный луч поворачивается на тот же самый угол, голограмма, освещенная одной эталонной волной, восстанавливает последовательность изображений в окрестностях оси вращения. Они кажутся освещенными с различных направлений соответствующим числом источников света.

- 194 -

1. А.С.Куниский, А.П.Дубров. Доклады АН СССР, 188, 2, 471, 1969.

2. Эдгар. Зарубежная радиоэлектроника. № 3, 1971.